人体内先天性免疫系统的自然杀伤细胞（NK）细胞具备以下特点：1）永远是走在最前线的战士，第一时间迎向病毒等病原体和癌变细胞；2）具有广谱“杀敌”作用，不需要特异性识别或者扩增，启动时间最快；3）反馈及时，发现“敌情”立即“上报”、并启动整个免疫系统。

目前，日本、台湾等地已将自体/异体NK细胞疗法用于临床抗肿瘤辅助治疗。相比之下其在感染领域的应用研究却较少。通常认为，T细胞和B细胞是抗病毒感染的主力军。而近来研究发现，NK细胞在巨细胞病毒、乙肝和艾滋病等多种病毒感染中也发挥重要作用：  

1．直接作用：NK细胞作为防御病毒的第一道防线，首先通过识别被病毒感染的细胞表面分子和免疫复合物，被激活后分泌穿孔素杀灭被病毒感染的宿主细胞。

2．免疫调节：NK细胞可通过结合细胞表面受体并在细胞因子刺激下促进DC细胞、巨噬细胞和T细胞的成熟和活化，对触发和促成T淋巴细胞抗病毒至关重要。同时，NK细胞还清除过度活化的CD4⁺T细胞和巨噬细胞以防止免疫病理损伤。

3．在机体产生了针对病毒抗原的特异性抗体后，NK细胞还可通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（ADCC）来杀伤感染的靶细胞，从而达到清除病毒的目的。    

在不同NK细胞来源中，脐带血使用安全、便利。即使长期冷冻保存也不会影响分离出的NK细胞扩增能力与免疫功能。且脐带血来源的NK细胞更加年轻，增殖能力更强，靶向杀伤癌细胞的效率也更高，收集和冷冻保存更加便捷。 

NKG2D是NK细胞的活化型受体，可识别MHC-I类分子，对天然免疫至关重要。NKG2D能识别表达在靶细胞表面的8种不同配体，故它可以同时靶向多种不同靶细胞；NKG2D的配体（NKG2DL）在正常细胞中不表达或者表达量非常少，但当细胞受到感染或者发生癌变时，这些配体的表达量则会大幅度上升，从而使其成为免疫治疗的理想靶点。

过继输入机体后，NK细胞若无IL-15等细胞因子持续支持，则成活时间非常短暂；与体内天然的非复合IL-15相比，超级IL-15（sIL-15/IL-15Rɑ sushi domain 融合蛋白）活性增加了近20倍，且具有改善的药代动力学特性、淋巴组织中更长的持久性和增强的靶细胞杀伤活性。

最新研究表明：因单核细胞-巨噬细胞参与了CAR-T细胞治疗后细胞因子风暴和神经毒性的发生发展，通过GM-CSF中和抗体能预防或延缓CAR-T细胞疗法导致的细胞因子风暴发生发展。  

CAR-NK细胞，又称加强版NK细胞，是通过基因工程手段修饰使其表达嵌合抗原受体，将识别靶细胞（如病毒感染的细胞、癌细胞）表面抗原的抗体（或受体）与激活免疫细胞所需的信号分子连接，可以突破抑制性受体的限制而激活NK细胞，以此增强NK细胞对靶细胞的特异性杀伤。越来越多的临床试验研究表明，CAR-NK抗肿瘤活性好，安全性高（无细胞因子风暴等严重毒副反应），可批量生产（为通用、即用型产品），应用前景极为广阔。例如，2020年2月6日《新英格兰医学杂志》发表了利用来源于脐带血的异基因NK细胞制备的CD19 CAR-NK细胞（分泌IL-15）试验治疗11位复发性/难治性非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴细胞性白血病患者的结果：有8位对治疗有反应，其中7位完全缓解（中位随访13.8个月时不再显示疾病迹象），且没有患者经历细胞因子风暴或神经毒性。

与SARS-COV相同，SARS-COV-2的受体是血管紧张素转化酶2（ACE2）。ACE2表达于肺、肾脏、胃、肠、心脏、骨髓、脾、肝、视网膜、胎盘、卵巢、脑组织、睾丸、冠状动脉、动脉、静脉、脂肪组织，以及内皮细胞、巨噬细胞等组织细胞。ACE2主要以膜连接蛋白的形式存在，在尿液及血浆中存在可溶性ACE2。ACE2和ACE分别具有扩血管和缩血管功能，共同维持着机体血压的稳态。ACE2定位于细胞的顶端，侧面及基底面未检测到ACE2的表达；SARS病毒的S蛋白也见于细胞的顶端。值得一提的是，SARS-COV进入NK细胞等外周血单个核细胞后不会产生病毒颗粒（顿挫性感染）。

目前，COVID-19尚无特效药物/疗法，尤其对高危人群尚无特效的应急救治方法。2020年3月24日北京大学第一医院感染科主任医师王贵强24日在国务院联防联控机制就新冠肺炎疫情防控与医疗诊治有关情况举行的发布会上介绍，有几个团队在进行新冠肺炎病亡患者解剖，目前对29例进行了尸体解剖。总体来看，肺部病变非常严重。在小的支气管里看到很多分泌物，这些分泌物堵塞了小气道，影响了气体的交换，直接影响到体内的氧合，氧就不够用了。电镜下，肺里还能够看到病毒颗粒。还有一个很重要的系统是受累比较重的，就是免疫系统。在新冠病毒感染的病亡人群里可以看到，患者的免疫功能受到了打击，这种打击是原因还是结果？目前还不清楚，但至少这个现象还是非常明确的，可以表现为脾脏缩小，淋巴结里的免疫细胞减少。临床上可以看到白细胞少、淋巴细胞减少和病情的进展甚至死亡有非常明确的相关性。因此，临床上对重症、危重症的患者，现在诊疗方案里也强调用一些免疫增强剂，提高免疫的办法，达到有效地控制SARS-CoV-2病毒复制的目的。此外，COVID-19诊疗方案中推荐的血清抗体疗法也必需NK细胞数量和功能正常或基本正常才会有较好疗效，因为除补体激活途径外，还需通过NK细胞的ADCC（抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用）杀灭并清除SARS-COV-2病毒及其感染的细胞。

因此，我们研制成功了源于脐带血的NKG2D-ACE2 CAR-NK细胞（分泌超级IL15和GM-CSF中和单链抗体），通过ACE2、NKG2D分别靶向SARS-COV-2病毒的S蛋白及其感染细胞表面的NKG2DL，借助超级IL15的强力增效作用、以及GM-CSF中和单链抗体预防或延缓细胞因子风暴的特效作用，特异地清除SARS-COV-2病毒颗粒及其感染的细胞，从而为COVID-19提供一种安全有效的细胞疗法。此外，ACE2 CAR-NK细胞还可通过ACE2竞争性抑制SARS-COV-2感染II型肺泡上皮细胞等重要器官组织细胞，并使进入CAR-NK细胞内的SARS-COV-2发生顿挫性感染。

本项目为开放、随机、平行、多中心的I/II临床试验研究。利用分泌超级IL15和GM-CSF中和单链抗体的NKG2D-ACE2 CAR-NK细胞（静脉输注，每公斤体重1亿个细胞，每周1次），治疗普通型、重型和危重型COVID患者各30例。 

在重庆市新型冠状病毒感染肺炎疫情应急科技攻关专项第二批项目计划资助下，我们研发团队与重庆市公共卫生医疗救治中心陈耀凯教授临床团队共治疗5位COVID-19患者（2例危重型、3例普通型），现已全部治愈出院。治疗过程中，原有的发热、肺炎等临床表现能更快地缓解，同时继发感染也能得到较好控制；常伴有中低发热（不超过38.8°C），但1天内可自行恢复正常；细胞治疗后1-3周SARS-COV-2病毒RNA转阴。因重庆再无患者入组，现正在武汉协和医院开展临床试验研究。尤其值得一提的是，这是国际上首次利用CAR-NK细胞疗法治疗病毒感染性疾病的临床试验研究，并初步显示安全有效！本项目的特色与创新之处：

1） CAR-NK细胞疗法安全性好：未见细胞因子风暴等严重毒副反应的报道。

2） 双靶点联合治疗：通过ACE2、NKG2D分别靶向SARS-COV-2病毒的S蛋白及其感染细胞表面的NKG2DL，CAR-NK细胞能有效地清除SARS-COV-2的病毒颗粒及其感染的细胞。

3） CAR-NK细胞活性强且持久：借助超级IL15的强力增效作用，CAR-NK细胞在机体内能克服免疫抑制微环境有效扩增。

4） CAR-NK细胞可安全高效地预防或延缓细胞因子风暴的发生发展：通过在炎症病灶局部分泌GM-CSF中和抗体，能预防或延缓细胞因子风暴的发生发展，且全身毒副作用小。

5） CAR-NK细胞的诱饵作用：通过ACE2竞争性抑制SARS-COV-2病毒颗粒感染II型肺泡上皮细胞等重要器官组织细胞，且使进入CAR-NK细胞内的SARS-COV-2病毒发生顿挫性感染、从而不能生产感染性病毒颗粒。

6） CAR-NK细胞对适应性免疫的调节作用：通过高表达CD16等膜受体和分泌细胞因子（如超级IL15），调节B细胞、NK-T和CD8 T的功能。

7） CAR-NK细胞对细菌、真菌、其它病毒等病原体也有防御作用，有助于防治并发和继发感染。

8） CAR-NK细胞具有通用性：为即用型的细胞治疗产品，适用于不同个体，可长期冻存备用。

我们团队长期致力于肿瘤免疫治疗，在CAR-T、CAR-NK细胞技术的研发上已形成一定的特色，贯穿慢病毒制备工艺、T细胞/NK细胞体外扩增和临床试验研究，已申报相关的8项发明专利。例如，靶向CD19的第二代、第四代CAR-T细胞（表达IL7和CCL19）治疗难治/复发性非霍奇金淋巴瘤的临床试验研究项目（NCT03258047），已在12家三甲医院（如浙江大学附属第一医院）开展，取得的临床疗效达到国际先进水平（第二代CAR-T细胞治疗39例，完全缓解率40%）或处于国际领先水平（第四代CAR-T细胞已治疗37例，完全缓解率56.8%）。

综上所述，若临床上证实防治COVID-19安全有效（尤其是应急救治和阻止轻症转重症），我们则拟申报NKG2D-ACE2 CAR-NK细胞的新药证书和生产批文，实现产业化。NKG2D CAR-NK细胞还适合于其它急性传染病的应急救治，故该通用、即用型CAR-NK细胞可作为战略产品储备。此外，NKG2D CAR-NK细胞还具有广谱的抗肿瘤作用，产业化前景极为广阔。

 

附：CAR-T、CAR-NK相关技术的发明专利：

1. 高基民、邓文海、钱文斌。一种体外扩增人外周血CD3+ T细胞的方法。发明专利申请号201810615865.7

2. 高基民、魏成。一种靶向多发性骨髓瘤多种抗原的嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞的构建方法及其应用。发明专利申请号201810592020.0

3. 邓文海、高基民、钱文斌。一种快速评估CAR-T细胞体外杀伤效率的方法。发明专利申请号201810566144.1

4. 高基民、李帆帆。一种第四代CAR-T细胞及其构建方法和应用。发明专利申请号20181303109.7

5. 高基民、魏成、赵爱。第四代CAR-T细胞（分泌表达IL15RA-IL15融合蛋白、CCL21）的构建与应用。发明专利申请号201910669740.7

6. 高基民、魏成、赵爱。GM-CSF敲低及其中和单链抗体分泌的嵌合抗原受体T细胞的构建和应用。发明专利申请号201910686302.1

7. 高基民、王可可、魏成。分泌白介素7和趋化因子21的CAR表达载体及应用。发明专利申请号201911231052.9

8. 高基民、魏成、王春玲、赵爱。第三代NKG2D嵌合抗原受体T或NK细胞的构建及应用。发明专利申请号202010139179.4

9. 高基民、魏成、赵爱、段德明。分泌超级IL15的NKG2D-ACE2 CAR-NK细胞的构建及其应用。发明专利申请号202010390688.4

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